前言

胆红素是一种黄色色素 ，是哺乳动物等异养生物中血红素分解代谢的产物。血红素是一种必需的生物分子，由四吡咯环和铁阳离子组成。在线粒体中合成后，血红素分布在整个细胞中，并作为辅助因子与各种蛋白质结合，在氧传输和电子转移等细胞功能中发挥重要作用。

从含血红素蛋白质分解中释放的游离血红素是一种强促氧化剂，可促进细胞氧化应激，因此其水平通过分解代谢得到严格控制。

(相关资料图)

血红素加氧酶打开并将血红素环氧化成线性四吡咯胆绿素，随后被胆绿素还原酶还原为胆红素。 胆绿素还原酶 使用还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为电子供体来还原胆绿素，使胆绿素还原酶NADPH的活性具有依赖性。

虽然胆红素有毒，在高浓度下会导致核黄疸，但它也是一种有效的抗氧化剂。体内胆红素水平轻度升高可防止细胞氧化损伤，降低动脉高血压和糖尿病等疾病的风险。

植物胆红素生产

由于 植物血红素 在叶绿体中被生物合成和分解代谢，瞬时表达编码质体靶向版本的UnaG的构建体，其中N端质体转运肽来自拟南芥Rubisco小亚基，在Nicotianabenthamiana，拟南芥和肝苔，UnaG在所有测试植物的叶绿体中表现出亮绿色荧光。

为了确定UnaG是否与植物细胞内的 内源性胆红素 相关，我们在本氏猪笼草叶中瞬时表达编码FLAG标记的TP-UnaG的构建体，并使用抗FLAG抗体免疫纯化UnaG-FLAG。免疫印迹分析证明了UnaG-FLAG免疫沉淀的效率。

免疫纯化的UnaG-FLAG在被蓝光激发时发出绿色荧光。ipUnaG和对照holorcUnaG的激发和发射光谱是相同的。ipUnaG和holorcUnaG之间荧光光谱的完美重叠表明UnaG-FLAG仅与 植物细胞中的胆红素结合 。

为了鉴定与ipUnaG结合的 胆红素 ，我们进行了高效液相色谱电喷雾电离质谱。ipUnaG的总离子色谱图显示主峰，串联质谱与标准胆红素相同。这些结果提供了强有力的证据，证明外源性表达的UnaG与植物细胞中存在的胆红素特异性结合。这些数据表明胆红素在广泛的植物物种中产生并在叶绿体中积累。

在缺乏参与血红素降解的酶的拟南芥突变体中表达了编码叶绿体靶向mCherry-UnaG的结构： 血红素加氧酶1和植物动态蛋白合酶 。mCherry提供了叶绿体中UnaG表达的视觉确认。在缺乏AtHO1的突变体中，其在野生型植物中将血红素转化为胆绿素，UnaG荧光比WT子叶表皮细胞低四倍。

在叶肉细胞中，荧光在hy1-100中几乎检测不到。在缺乏 植物动蛋白合酶 的突变体中，催化胆绿素形成植物动蛋白的酶，子叶表皮细胞和叶肉细胞中的UnaG荧光与WT中的荧光相当。这些结果表明，胆红素的产生发生在胆绿素之后，而不是在植物性运动蛋白生物合成之后。

胆绿素在体外存在较高浓度的NADPH的情况下非酶促转化为胆红素

植物中的血红素加氧酶反应需要铁氧还蛋白和其他电子供体与血红素加氧酶之间的协调。考虑到 胆绿素还原酶基因 的同系物尚未在植物基因组中鉴定出来，假设胆绿素和胆红素都是由铁氧还蛋白或其他电子供体在血红素降解反应中的作用产生的。

所以需要对体外 血红素加氧酶 进行测定，重建了叶绿体。该测定包含重组AtHO1、血红素、铁氧还蛋白-NADP氧化还原酶/铁氧还蛋白电子转移系统以及基于葡萄糖-6磷酸脱氢酶的NADPH再生系统。

在25°C孵育8小时后，与AtHO1的反应溶液呈黄绿色，而缓冲液对照仍为红色血红素。停止反应并用 有机溶剂除去酶 后，浓缩反应产物并将其溶解在二甲基亚砜中。使用液相色谱-质谱分析，我们确定是否合成了胆红素和胆绿素。

TIC表现出与 胆红素和胆绿素标准品 对应的产物离子质谱峰，表明胆红素和胆绿素的合成。这些结果表明，尽管缺乏胆绿素还原酶，但在血红素降解过程中仍会产生胆红素。

没有血红素和AtHO1，胆绿素也可以转化为胆红素。这一观察结果表明，除AtHO1以外的酶和辅因子将胆绿素转化为胆红素。逐一省略了 其他酶和辅因子 ，从而描述胆绿素转化为胆红素所需的因子。G6PD是一种将NADP转化为NADPH的酶，胆绿素在异养生物中利用NADPH作为电子供体还原为胆红素。

当混合胆绿素和NADPH时，我们观察到胆红素以NADPH浓度依赖性方式产生。将不同浓度的NADPH与胆绿素反应，并监测胆绿素随时间推移的减少。 胆绿素以NADPH和胆绿素浓度依赖性方式转化为胆红素 ，胆绿素的降解速率似乎与NADPH和胆绿素浓度的三分之二次方成正比。

当通过薄层色谱分离胆绿素和NADPH的反应产物时，在高和低R处检测到两个胆红素样黄色斑点+fNADPH浓度为0.1mM或更高的值。高R点f值为胆红素，因为它们与胆红素标准一致。低R的黄色斑点f值主要在低NADPH浓度下产生，其中将一个 氢离子 引入胆绿素分子中。将从NADPH引入另一个氢离子以产生胆红素。

NADPH水平升高促进植物胆红素的产生

高光照激发光系统I并增加叶绿体中的NADPH浓度，如果 胆红素 是通过与NADPH反应直接合成的，那么在高强度光照射期间，胆红素的产生预计将短暂增加。通过共聚焦激光扫描显微镜间歇性地用470、530、590或650nm激光照射表达TP-mCherry-UnaG的拟南芥叶2小时。

用590或650nm激光照射显着增加了UnaG荧光和UnaG/mCherry比率。mCherry的荧光强度没有减弱，证实了 荧光蛋白没有发生漂白 。590和650nm的波长比470或530nm具有更高的光合作用相对量子效率，这表明光系统被这些波长激活得更强，并产生更多的NADPH。

为了进一步测试叶绿体中胆红素的非酶促产生，我们评估了过表达拟 南芥NAD激酶2的本氏奈瑟菌细胞中的TP-UnaG荧光 。NADK2磷酸化NAD并增加叶绿体中NADP的量。与表达TP-tagRFP的细胞相比，在NADK2-tagRFP的细胞的叶绿体中观察到更强的UnaG荧光。

叶绿体中UnaG荧光的定量显示，NADK2-tagRFP过表达显着增加荧光强度至对照的两倍，表明NADPH水平升高可促进 叶绿体中胆红素的产生 。

这些结果可以表明，增加叶绿体中NADPH浓度可促进胆红素的产生，支持通过 胆绿素和NADPH 之间的非酶促反应在植物中产生胆红素的观点。

胆红素的产生降低了叶绿体中的活性氧水平

高光照射刺激胆红素的产生，但是与光照生长的幼苗相比，在黑暗中生长24小时的拟南芥幼苗显示出叶片中胆红素浓度的增加。在 叶肉细胞 中，在黑暗中9小时后叶绿体胆红素水平比光照生长幼苗高1.24倍。

在24小时后，深色处理幼苗的根表皮细胞中的质体胆红素水平没有显着变化。由于 胆红素在哺乳动物中具有抗氧化特性 ，胆红素被光合作用产生的活性氧降解的速度快于其产生的速度。

BVRA的稳定表达影响光合作用，但这种瞬时BVRA表达不影响光合效率。为了分析ROS水平，必修使用ROS指示剂 二氯二氢荧光素二乙酸酯 ，在乙酸基团被细胞内酯酶去除后，在细胞ROS存在下被氧化时会发出荧光。

共聚焦显微镜 显示TP-BVRA积累降低H2叶绿体中的DCFDA荧光与表达TP-tagRFP的对照叶相比。H的定量2叶绿体中的DCFDA荧光强度表明，TP-BVRA的积累显着降低了ROS水平，表明胆红素的产生降低了叶绿体ROS水平。

结论

这项研究提供了证据，证明胆红素被认为是一种动物色素，是由 植物中的胆绿素非酶促产生的 。在早期分化的陆地植物M.polymorpha以及被子植物N.benthamiana和拟南芥中检测到胆红素，我们建议几乎所有陆地植物，包括作物，都可能产生胆红素。

NADPH介导的胆绿素的非酶促转化似乎比哺乳动物中胆绿素还原酶介导的反应动力学慢。考虑到 动物和植物之间的生理差异 ，假设植物中非酶胆红素产生的两个潜在原因。植物分解代谢的血红素比动物少得多。

3周龄拟南芥植物的气上组织中未结合的血红素含量估计为0.75nmol/g鲜重。即使所有血红素在1天内降解，植物中按体重计算的降解血红素量也约为1/10人类的。 植物可能根本不需要与动物相当的高速血红素降解系统 。

植物细胞中的NADPH浓度高于动物细胞。动物细胞中的NADPH浓度估计在细胞质中为3μM，在线粒体中为37μM。叶绿体基质中的NADPH浓度估计为0.29至0.5mM。 这种高NADPH浓度可能能够以相对较高的反应速率非酶促生产胆红素 。估计当0μM胆绿素与27.50mMNADPH孵育时，胆绿素以大约0.5μM/小时的速度降解。

在人细胞培养物中，主要由BVRA介导的胆红素产生速率估计为每小时几微摩尔，表明 植物细胞中估计的胆红素产生速率并不比哺乳动物细胞慢多少 。如果NADPH和胆绿素集中在叶绿体内的亚域中，则该反应速率将进一步增加。

铁氧还蛋白将光系统I产生的电子转移到NADP，导致NADPH产生，但 铁氧还蛋白 也需要作为血红素加氧酶活性的电子供体。所以当光系统I被激活时，胆绿素和NADPH的产生同时增加。在光系统I所在的类囊体膜上，局部可能发生比上述浓度更高的胆绿素和NADPH，导致胆红素产生率高于的预估情况。

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